在Geneious Prime中设计Taqman®和qPCR引物

Geneious中的“设计新引物”工具提供了创建适用于Taqman或定量PCR（qPCR）分析的引物/探针集所需的所有必要选项。

如果要设计标准qPCR引物，则不要包括探针引物。 

首先，用户需要查阅文献并为其qPCR或Taqman分析选择合适的设计规则。设计规则可能会有所不同，具体取决于用于检测的聚合酶/缓冲液系统。例如，适当的设计规则可能是：

 

1Primer Tm标准：

Forward and Reverse Primer Tm should be around 58-60 °C. Tm of the primers should be equal.

2探针 Tm标准：（仅限Taqman）

 TaqMan®探针的Tm应该比Primer Tm高10°C。 

3引物和探针％G + C含量： 

Primer ％G + C含量应为30-80％。

4引物和探针GC夹：

引物3'端最后五个核苷酸中G和C的总数不应超过两个。 

5引物长度标准： 

所有引物的长度应为15-30个碱基。

6引物运行并重复（Max Poly-X）：

引物/探针不应具有大于4的相同核苷酸序列。

7Primer G / C分布： 

Cs应该比Gs多，而不是5'端的G。

8扩增子长度： 

扩增子大小不应超过400 bp，理想情况下应为50-150个碱基。

 

Geneious可以为所有规则（规则7除外）设计qPCR和Taqman引物，但这很容易通过注释表（请参见下文）进行直观检查。

 

要创建qPCR和Taqman引物：

选择目标序列，在工具栏上选择“ 引物->设计新引物” ：

使用类似以下设置的内容。

将任务设置为设计新的：

检查设计正向和反向引物的选项。 

检查设计DNA探针的选项（ 仅限Taqman ）

将任务设置为通用：

将产品尺寸设置为50至150

将最佳产品尺寸设置为125

将“要生成的线对数”设置为5-10。  这将为您提供一系列引物，您可以检查这些引物以确认至少一个引物符合规则7。

 

在“入门”选项卡中设置入门设置

在“特性”->“入门”窗格（突出显示的洋红色）中：

设置较大的尺寸范围

设置一个严格的Tm范围58°C至60°C，最佳59°C

将％GC范围设置为30°C至80°C，最佳50°C。

将最大Tm差设置为5°C

将“ GC Clamp”设置为0（这将防止引物以G或C结尾）

将“ Max Poly-X”设置为4（这将排除具有较长均聚物区域的引物）

将“最大3'稳定性”设置为4（这将有助于在引物3'端提高A / T含量）

​

在“探针”选项卡中设置探针设置（仅Taqman）

然后单击“ DNA探针”选项卡（标记为洋红色）并设置探针的Tm设置。

将 Tm 范围设置为 68°C-70°C，最佳为 69°C（比底漆 Tm 高 10°C）

Ser Max Poly-X to 4 (this will exclude primers with longer homopolymer regions)

​​

 

保存设计设置

在运行“设计新引物”工具之前，您可以保存qPCR或Taqman特定的设计设置以备将来使用：

单击设置窗口左下角的齿轮，转到->“保存当前设置”。

要在以后访问设置，请转至Primers-> Design new Primers，单击齿轮图标，然后选择Load Profile。

 

 

按确定，该工具将设计指定的引物/探针对数。  新的引物将标注在靶序列上。  

 

通过注释表检查并验证引物集

然后，您应该检查注释表中的底漆，以确保它们符合设计规则。

单击序列查看器中的“注释”选项卡：

设置类型：显示“ 某些” ，设置为显示“ DNA探针绑定”（仅限Taqman），“ Primer Bind”和“ Primer Bind（Reverse）”类型

使用列按钮/下拉菜单显示相关元数据，例如，选中显示序列、“产品尺寸”、Tm 列的选项。 

Confirm there are no extended G+C clamps at 3' end of the primers and that the primers/probe conform to rule 7, where there should be more Cs than Gs, and not a G at the 5' end(see below, marked by red arrow).

​​

Finally, on the Toolbar, go Primers -> "Extract PCR product" to extract the chosen product using the chosen primer set.

​​

Select the extracted product, view the statistics (%) Tab associated with the extracted PCR product and check the ​extracted PCR product has an acceptable %G+C.

​

一旦有了一组引物/探针以及符合qPCR或Taqman设计标准的最终产物，请在查询序列上选择引物注释，然后单击“提取”以将引物/探针提取到新的单个引物序列中。

然后，您可以从您最喜欢的DNA合成服务提供商处订购引物，并确保在探针的5'和3'末端指定适当的荧光团/猝灭剂添加物。