如何根据比对设计简并引物？

 使用“ 设计新引物”操作

Geneious Prime可以使用“引 物”菜单下的“ 设计新引物”工具根据比对设计简并引物 。

For example, if you want a degenerate primer pair with primer Tm's of around 54°C, a minimum PCR product length of 150 bp (alignment is 684 bp long), and a maximum allowed degeneracy of 32 then you would use settings similar to those shown below.

选中“ 允许简并性选项”并设置适当的值（有关简并性的说明，请参见上面的在线手册第13.1.6节）。

确保以下选项设计入门：达成共识 。

单击“ 共识选项”按钮，并将阈值设置为100％-如果希望引物简并并入每个变体碱基，则将阈值设置为相同 。  If you are using a larger alignment, and want your degeneracy to cover bases found in 90% of the sequences, set the Consensus threshold to 90% rather than 100%.  通过此设置，将在10个序列中有9个相同的位点使用最常见的碱基，而不是为单个变异核苷酸添加简并碱基。  

 

 

设计新的入门工具可能适合您的需求。  但是，请注意，即使总的简并度很低，它也会使简并度非常接近引物的3'末端，这可能会大大降低其有效引物的能力。

 

手动设计简并引物

 您也可以使用以下步骤手动进行简并引物设计。

1。选择对齐方式，确保已达成共识，并且已针对所需的简并水平适当设置了阈值。  确保“突出显示”已启用，以轻松查看差异。

2使用身份图作为指导直观地识别简并引物位置的合适区域，放大并识别简并引物位置的理想区域。  寻找差异最小的区域，如果可能，在引物的3'端使用尽可能完全保守的“夹具”（尽可能长）。

3在路线的共识线上，选择要定义为引物的区域，从左向右拖动/选择以获取正向引物，从右向左拖动/选择以获取反向引物。 

如果您正在使用Geneious Prime 2019，则会看到一个浮动工具提示，其中详细列出了所选区域的计算出的Tm，以及一个添加引物按钮（红色方框）。

 

如果您使用的是Geneious的早期版本，请选择区域，查看“统计信息”侧窗格以查看估计的Rough Tm ，然后转到“引物->选择特征”以添加新引物。

4单击绿色的“添加引物”按钮，将打开“添加注释”窗口，您将看到引物的计算特征，包括基于简并性的Tm范围，如果对引物特征满意，请给引物命名： 单击确定 ，并且底漆将作为注释添加到共识中。

 

 

 

5如果您手动创建正向和反向引物并希望配对，则在序列上同时选择它们（选择第一个，然后在第二个菜单上按CTRL或命令单击），然后右键（或CTRL）单击一个并选择配对选定的引物（在Primer 2019.2.1及更高版本中可用）。

 

 

引物现在将具有针对产品尺寸和潜在引物二聚体问题计算的关联信息。  将鼠标悬停在引物注释上可以查看此信息。

 

 

6选择每个引物注释（选择第一个，然后单击CTRL或在第二个命令上单击），然后单击“ 提取”以提取注释以创建新的独立引物序列文件。